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酶結(jié)合物的制備

    免疫酶技術(shù)（immunoenzymatic technique）又稱酶免疫測(cè)定法（enzyme immunoassay,EIA）,是繼免疫熒光技術(shù)和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的又一種免疫標(biāo)記技術(shù)。它是把抗原抗體的特異性反應(yīng)和酶的催化作用相結(jié)合而建立的。該技術(shù)通過(guò)化學(xué)方法將酶與抗體或抗抗體結(jié)合，形成酶標(biāo)記物，這些酶標(biāo)記物仍保持免疫學(xué)活性和酶的活性，然后將它與相應(yīng)的抗體或抗原起反應(yīng)，形成酶標(biāo)記復(fù)合物，結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶，在遇到相應(yīng)的底物時(shí)，則催化底物產(chǎn)生水解、氧化或還原等反應(yīng)，而生成可溶性或不溶性有色物質(zhì)。然后根據(jù)顯色的深淺來(lái)反映待測(cè)樣品中抗原或抗體的含量，如生成的有色物質(zhì)為可溶性，則可用肉眼比色或酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定光密度值（OD）定性或定量；如生成的有色物質(zhì)為不溶性沉淀物，同時(shí)又是電子致密物質(zhì)，則可用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡識(shí)別和定位。因此，免疫酶技術(shù)是一項(xiàng)定位、定性和定量（敏感度可達(dá)每毫升ng~pg水平）的綜合技術(shù)。常用的酶是辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）。

    酶標(biāo)抗體或抗抗體（抗免疫球蛋白）結(jié)合物可采用戊二醛法或過(guò)碘酸鹽氧化法制備。郭春祥建立的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體的改良過(guò)碘酸鈉法簡(jiǎn)單易行，標(biāo)記效果好，特別適用于實(shí)驗(yàn)室的小批量制備。現(xiàn)將操作方法介紹如下： 

    （一） 結(jié)合物的標(biāo)記將5mg HRP溶于05ml蒸餾水中，加入新配制的006mol/L NaIO4水溶液05ml，混勻，置冰箱30min，取出加入016mol/L乙醇水溶液05ml，室溫放置30min后，加入含5mg純化抗體的水溶液（或PBS）1ml，混勻并裝透析袋，以005mol/L、pH值95碳酸鹽緩沖液緩慢攪拌透析6h（或過(guò)夜）使之結(jié)合，然后吸出加NaBH4溶液（5mg/ml）02ml，置冰箱2h。將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨，冰箱放置30min，離心，將所得沉淀物溶于少許002mol/L、pH值74 PBS中，并對(duì)之透析過(guò)夜。次日再離心除去不溶物，即得酶抗體結(jié)合物。用002mol/L、pH值74 PBS加至5ml，進(jìn)行測(cè)定后，冷凍干燥或低溫保存。 

    （二） 結(jié)合物中HRP與抗體量的測(cè)定酶標(biāo)結(jié)合物于751型分光光度計(jì)上分別用280及403nm波長(zhǎng)測(cè)定其光密度（OD），并計(jì)算出OD403與OD280之比值以及HRP與抗體的mol/L比。

結(jié)合物中HRP濃度（mg/ml）=OD403×04 

結(jié)合物中IgG濃度（mg/ml）=（OD280-OD403×03）×062 

酶/抗體mol/L比=HRP濃度IgG濃度×4 

    （三） 結(jié)合物稀釋度的測(cè)定

用酶結(jié)合物中抗體相應(yīng)的抗原直接包被聚苯乙烯反應(yīng)板，采用ELISA直接法測(cè)定酶結(jié)合物效價(jià)。通常本法制備的酶結(jié)合物作1∶10 000稀釋時(shí)，其OD403仍在01以上。