ECL發光液（Enhanced Chemiluminescence，增強型化學發光）是Western Blot實驗中常用的蛋白檢測手段，其核心原理是在辣根過氧化物酶（HRP）催化下，魯米諾（Luminol）與（H?O?）發生氧化反應，生成激發態中間體并釋放光子（波長約425 nm），從而產生可被X光膠片或成像系統捕獲的熒光信號。
以下是標準且高效的ECL發光液使用方法：
一、工作液配制
?現配現用?：大多數ECL發光液由A液（發光底物）和B液（增強劑/過氧化物）組成，需在使用前等體積混合（如1:1）。
?避光操作?：混合過程應避光進行，防止試劑提前降解。
?即用型產品?：部分新型超敏發光液為即用型，無需預混，可直接滴加，減少污染風險。
二、膜處理與孵育
完成轉膜、封閉、一抗與二抗孵育后，用PBST或TBST充分洗滌3次，每次5–10分鐘。
用平頭鑷取出膜，濾紙輕吸去多余液體（勿接觸蛋白面）。
將膜蛋白面朝上置于潔凈保鮮膜或塑料容器中。
三、發光反應
根據膜面積滴加ECL工作液（推薦用量：?0.1–0.125 mL/cm2?），確保覆蓋。
室溫孵育1–3分鐘（超敏試劑可縮短至10–15秒），避免過長時間導致背景升高。
輕輕瀝干多余液體，勿水洗。
四、信號檢測
?壓片檢測?：
將膜夾于兩層保鮮膜之間，趕盡氣泡。
放入暗盒，蛋白面朝上，覆蓋X光膠片。
曝光時間從數秒至數小時不等，弱信號可延長至10小時。
?化學發光成像儀檢測?：
直接將膜放入成像儀，按設備說明采集圖像。
可實時調整曝光時間，避免過曝或信號不足。
